최적화된 비색 RT 개발

Apr 04, 2023

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 21424(2022) 이 기사 인용

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코로나바이러스 대유행으로 인해 분자 진단 테스트의 필요성이 더욱 강조되었습니다. 이를 위해 많이 사용되는 기술은 분자 진단의 최적 표준으로 일반적으로 사용되는 민감하고 구체적인 기술인 중합효소 연쇄 반응(PCR)입니다. 그러나 고도로 훈련된 인력과 유지 관리 수준이 높은 장비가 필요하며 상대적으로 시간이 많이 걸립니다. 대안으로 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 기술이 있는데, 이는 시료 정제나 고가의 장비가 필요하지 않으며 민감도와 특이도 측면에서 PCR과 유사합니다. 본 논문에서는 휴대용 장치를 사용하여 코로나19를 진단하는 최적화된 비색 역전사 효소 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 현장 진단 테스트를 개발했습니다. 프라이머 농도, 황산마그네슘, 베타인, 염산염 구아니딘, Bst 및 반응 온도와 같은 변수를 테스트했습니다. 또한 반응 테스트 튜브에 추가된 샘플 부족으로 인한 위음성을 방지하기 위해 염료 조합을 사용하여 피펫팅 품질 관리 시스템을 만들었습니다. 가열 뚜껑을 사용할 수 없을 때 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일이 RT-LAMP 반응의 구성에 통합되었습니다. 최종 RT-LAMP 테스트는 New England Biolabs의 WarmStart Colorimetric Master 믹스와 비교할 때 μL당 5개 복사본의 감도로 10배 더 민감합니다.

2019년 12월, 전 세계는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)라는 새로운 코로나바이러스의 결과를 목격했습니다. SARS-CoV-2의 첫 번째 감염 사례는 중국 우한에서 보고되었으며, 곧 전 세계로 확산되어 20201년 3월 새로운 팬데믹으로 알려졌습니다. 팬데믹의 발발은 분자생물학의 세계적인 필요성을 드러냈습니다. 질병의 확산을 통제하기 위한 수단으로 감염된 사람을 식별, 격리 및 치료하기 위한 검사입니다.

역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)2은 일반적으로 SARS-CoV-2와 같은 RNA 바이러스의 분자 테스트를 위한 최적의 표준 기술로 알려져 있습니다. RT-PCR은 민감도와 특이도가 높은 기술이지만, 고가의 유지 관리 장비, 광범위한 시료 정제 단계, 고도로 훈련된 인력이 필요합니다. 감염자가 급격히 증가함에 따라 분자 검사를 위한 시약, 투입물, 인력 및 장비가 부족하다는 것이 명백해졌고 전 세계는 수요를 충족할 실험실 자원이 부족했습니다.

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)는 20003년 Notomi와 그의 동료들에 의해 등온 조건에서 수행될 수 있는 높은 특이성과 효율성을 갖춘 핵산 증폭 기술로 처음 설명되었습니다. 이는 가닥 치환 DNA 중합효소(5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없음)와 합성된 단일 가닥 DNA에 루프를 생성하도록 설계된 2~3쌍의 프라이머 세트를 사용합니다. 중합효소가 새로운 증폭을 시작할 때마다 이전에 결합된 DNA 가닥을 방출하고, 이는 중합효소에 대한 새로운 결합 부위를 포함하는 루프 구조를 형성하여 자가 전파 증폭을 생성합니다. 반응의 최종 생성물은 교대로 역전된 표적의 반복 사이에서 어닐링에 의해 형성된 다중 루프를 갖는 콜리플라워와 유사한 구조입니다3. PCR뿐만 아니라 LAMP 반응은 역전사 효소와 결합되어 RNA 분자의 증폭을 수행할 수도 있습니다.

LAMP 반응에서 발생하는 높은 수준의 DNA 합성을 통해 양성 반응을 시각적으로 감지할 수 있습니다. DNA 중합효소가 새로 합성된 DNA 가닥에 dNTP를 통합할 때마다 부산물로 피로인산염과 양성자 분자를 방출합니다. 피로인산염은 Mg2+ 이온이 존재할 때 피로인산마그네슘으로 침전되어 반응의 탁도를 변화시킵니다. 방출된 양성자는 반응의 pH를 감소시키며, 이는 페놀 레드 및 브로모티몰 블루와 같은 pH 민감성 비색 염료를 사용하여 감지할 수 있습니다4,5.