분열 효모 Srr1 및 Skb1은 동원체에서 이소염색체 형성을 촉진합니다.
Apr 11, 2023커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 551(2023) 이 기사 인용
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Rad51은 게놈 무결성을 유지하는 반면 Rad52는 비표준 상동 재조합을 유발하여 총 염색체 재배열(GCR)을 초래합니다. 여기서 우리는 핵분열 효모 Srr1/Ber1 및 Skb1/PRMT5가 동원체에서 GCR을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 유전적 및 물리적 분석에 따르면 srr1 및 skb1 돌연변이는 동원체 반전 반복에 의해 매개되는 등색체 형성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. srr1은 rad51 세포의 DNA 손상 민감도를 증가시키지만 체크포인트 반응을 폐지하지는 않습니다. 이는 Srr1이 Rad51 독립적인 DNA 복구를 촉진한다는 것을 의미합니다. srr1 및 rad52는 추가로, skb1 및 rad52는 GCR을 상위적으로 감소시킵니다. srr1이나 rad52와 달리 skb1은 손상 민감도를 높이지 않습니다. Skb1은 각각 Slf1과 Pom1을 사용하여 세포 형태와 세포주기를 조절하지만 Slf1이나 Pom1은 GCR을 유발하지 않습니다. Skb1의 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 도메인에 있는 보존된 잔기를 돌연변이시키면 GCR이 크게 감소합니다. 이러한 결과는 아르기닌 메틸화를 통해 Skb1이 Rad52 의존성 GCR로 이어지는 비정상적인 DNA 구조를 형성함을 시사합니다. 이 연구는 동원체의 GCR에서 Srr1 및 Skb1의 역할을 밝혀냈습니다.
전좌와 같은 총 염색체 재배열(GCR)은 진핵생물 게놈에 풍부하고 널리 퍼져 있는 반복 서열을 사용하여 발생할 수 있습니다1. 인간의 경우 위성 반복 및 전이 요소를 포함한 반복 서열의 총 수가 게놈의 54%를 차지합니다2,3. GCR은 암을 포함한 세포 사멸과 유전 질환을 유발합니다. 반면, GCR은 게놈 다양성을 창출함으로써 진화의 원동력이 될 수 있습니다4. 따라서 GCR은 병리적인 현상일 뿐만 아니라 생리적인 현상이기도 합니다.
적절한 염색체 분리를 보장하는 동원체에는 많은 진핵생물의 반복적인 DNA 서열이 포함되어 있습니다. 인간 동원체(≥ 3 Mb)에는 α 위성 및 기타 유형의 위성 반복, 전이 가능한 요소 및 분절 중복이 포함되어 있습니다. α 위성의 고차 반복을 포함하는 동원체 반복의 방향은 동원체 내의 스위치로 역방향 DNA 반복을 형성합니다. 염색체 분리에서 중요한 역할에도 불구하고 동원체는 염색체 파손 및 재배열6,7,8,9,10의 핫스팟입니다. 동원체에서 반복적인 서열 간의 재조합은 비정상적인 염색체를 형성합니다11,12,13. 동원체 또는 그 주변의 두 개의 말단중심 염색체의 융합인 로버트소니안 전좌(Robertsonian translocation)는 인간에서 가장 흔히 관찰되는 염색체 이상 형태로, 신생아 1000명 중 1명에게 영향을 미칩니다14. 팔이 서로 거울상인 등색체는 암세포에서 흔히 발견됩니다15. chr21과 chrX의 이소염색체는 각각 다운 증후군과 터너 증후군을 유발합니다. 포유류 동원체와 비교하여, 핵분열 효모 S. pombe 동원체는 짧지만(35~110kb) 비반복적 핵심 서열 옆에 반전된 DNA 반복이 포함되어 있습니다18,19. 이 곰팡이에서 동염색체는 동원체20,21,22의 역전된 DNA 반복을 사용하여 생성됩니다. 동원체 DNA 서열의 복잡성이 적기 때문에 분열 효모는 동원체 GCR의 메커니즘을 연구하는 데 탁월한 시스템이 됩니다.
이중 가닥 절단과 같은 해로운 DNA 손상을 복구하려면 상동 재조합이 필요합니다. Rad51은 표준 상동성 재조합의 핵심 역할을 하며 상동성 검색 및 DNA 가닥 교환을 촉매하여 변위 루프를 형성합니다. 포유류 BRCA1과 BRCA2는 Rad51 의존성 재조합을 촉진하고 이들의 돌연변이는 GCR을 증가시키고 운반체가 암에 걸리기 쉽게 만듭니다. 상동 재조합은 동원체 무결성을 유지합니다. 포유류에서 Rad51의 불활성화는 동원체9,10,26에서 비정상적인 재조합을 증가시킵니다. 핵분열 효모에서 Rad51의 손실은 동원체20,21,27에서 이소염색체 형성을 증가시킵니다. 분열 효모를 사용한 상세한 분석에 따르면 Rad51은 보존적인 재조합 방식, 즉 동원체27,28에서의 비교차 재조합을 우선적으로 촉진하여 이소염색체 형성을 억제하는 것으로 나타났습니다.
300 cells are counted at each point. Pearson's Chi-square test of the septation index between wild-type and other strains at t = 8 h showed that srr1Δ or skb1Δ did not significantly change the septation index (p > 0.05) but chk1Δ increased it. c Chk1 phosphorylation in response to MMS treatment. Before and after 4 h treatment with 0.01% MMS, extracts were prepared from chk1+ (TNF7555) and chk1-HA+ cells of wild-type, srr1Δ, and skb1Δ (TNF8441, 8799, and 8802) and separated by 8% SDS-PAGE. Chk1-HA was detected by Western blotting using anti-HA antibodies (16B12). Whole proteins were stained using Coomassie brilliant blue. Size markers (Takara, 3454 A, CLEARLY stained protein ladder) are shown on the left. wt, wild-type. Uncropped images are shown in Supplementary Fig 6. d Wild-type and srr1Δ (TNF5369 and 5774) cells were plated onto adenine-limited YE plates, on which ade6– cells form red colonies. e Chromosome loss rates of wild-type, srr1Δ, srr1-W157R, skb1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ, and skb1Δ rad51Δ strains (TNF5369, 5774, 8308, 5772, 5411, 8344, and 5788). The two-tailed Mann-Whitney test. **p < 0.01; ***p < 0.001. Numerical data underlying b, e are provided in Tables C and D, respectively, in Supplementary Data 1./p> 2 × 109 cells mL−1. 100 μL of the cell suspension was mixed with 5 µL of salmon sperm DNA (10 mg mL−1) and the introducing DNA and incubated at room temperature for 10 min. After adding 260 μL of PEG/LiAc/TE (40% PEG4000, 0.1 M lithium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA), the tube was further incubated for 30 min with rotation. After adding 43 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO), the tube was incubated at 42 °C for 5 min. Cells were harvested by centrifugation at 503 × g for 30 s, suspended in YE or YE3S media, and plated on non-selective media. After one day of incubation, the cells were replica plated onto a medium supplemented with G418 (Nacalai Tesque, 09380–86) or hygromycin B (Nacalai Tesque, 09287–87) at a final concentration of 100 µg mL−1 or clonNAT (Werner BioAgents, 5.001.000) at 50 µg mL−1 to select the transformants. We did not pick up exceptionally large colonies of rad52 mutants because they can contain an fbh1 mutation62./p> 300 nuclei were counted in each experiment. Three independent experimental values and their means were shown in the graph using GraphPad Prism 9 for MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA). Images were processed using ImageJ2 2.9.0 or Adobe Photoshop Elements 2020./p>
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